生物技术制药酶工程制药.ppt
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生物技术制药酶工程制药学习要求学习要求掌握掌握:
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酶分离纯化的一般过程、固定化酶的性质和指标、酶反应器的性能评价及操作性质和指标、酶反应器的性能评价及操作了解了解:
酶工程的研究现状、酶工程在制药中:
酶工程的研究现状、酶工程在制药中的应用、治疗性的酶类药物的应用、治疗性的酶类药物本章主要内容本章主要内容概述概述1酶工程技术酶工程技术2酶工程研究新技术酶工程研究新技术3酶工程在制药工业中的应用酶工程在制药工业中的应用4第一节第一节概概述述一、酶与酶工程一、酶与酶工程1.酶(酶(Enzyme)u具有具有催化活性催化活性和和高度专一性高度专一性的生物催化剂的生物催化剂。
u催化特点:
催化特点:
高效性高效性专一性专一性可调控可调控不稳定不稳定1.酶(酶(Enzyme)u根据化学本质分为:
根据化学本质分为:
蛋白酶(蛋白酶(P酶)酶)核酸酶(核酸酶(R酶)酶)蛋白酶蛋白酶单纯酶单纯酶结合酶结合酶(全酶)(全酶)=酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子辅酶辅酶辅基辅基u酶工程:
酶工程:
酶学酶学、微生物学微生物学与与工程学工程学相互渗透相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。
结合、发展而形成的一门新的技术学科。
u化学酶工程(初级酶工程):
化学酶工程(初级酶工程):
通过化学修饰、酶的固定化、化学合成等改通过化学修饰、酶的固定化、化学合成等改善酶的性质,提高催化效率善酶的性质,提高催化效率u生物酶工程(高级酶工程):
生物酶工程(高级酶工程):
通过通过DNA重组技术生产目标酶,定向修饰与重组技术生产目标酶,定向修饰与改造获得突变酶、合成全新的酶等改造获得突变酶、合成全新的酶等2.酶工程酶工程(enzymeengineering)二、酶工程研究的产生与发展二、酶工程研究的产生与发展1894年,年,日本科学家首次从日本科学家首次从米曲霉米曲霉中提炼出中提炼出淀粉酶淀粉酶,并将淀粉酶用作治疗消化不良的药并将淀粉酶用作治疗消化不良的药物物,从而开创了人类有目的的生产和应用酶从而开创了人类有目的的生产和应用酶制剂的先例。
制剂的先例。
1908年,年,德国科学家从动物胰脏中提取出德国科学家从动物胰脏中提取出胰胰酶酶(胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合物物),),并将胰酶用于皮革的鞣制。
并将胰酶用于皮革的鞣制。
1911年,年,美国科学家从木瓜中提取出美国科学家从木瓜中提取出木瓜蛋木瓜蛋白酶白酶,并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物白质浑浊物。
酶工程的名称出现在酶工程的名称出现在20世纪世纪20年代,主要指年代,主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。
自然酶制剂在工业上的规模应用。
二、酶工程研究的产生与发展二、酶工程研究的产生与发展u1953年,年,Grubhoger和和Schleith提出了提出了酶固酶固定化技术定化技术。
u1969年,日本科学家在工业上利用年,日本科学家在工业上利用固定化氨固定化氨基酰化酶基酰化酶拆分了拆分了DL-氨基酸。
氨基酸。
u1971年,年,第一届国际酶工程会议第一届国际酶工程会议提出酶工程提出酶工程的主要内容:
酶的生产、分离纯化、酶的固的主要内容:
酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。
的应用。
二、酶工程研究的产生与发展二、酶工程研究的产生与发展20世纪世纪90年代,借助基因工程技术,可经过年代,借助基因工程技术,可经过酶基因重组,利用微生物表达生产酶制剂。
酶基因重组,利用微生物表达生产酶制剂。
基因工程基因工程+发酵技术发酵技术+发酵设备发酵设备二、酶工程研究的产生与发展二、酶工程研究的产生与发展三、现代酶工程的研究内容三、现代酶工程的研究内容1.酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发;用开发;2.酶和细胞的固定化及酶反应器的研究酶和细胞的固定化及酶反应器的研究3.酶的分子改造和化学修饰;酶的分子改造和化学修饰;4.有机相中酶反应的研究;有机相中酶反应的研究;5.酶抑制剂、激活剂的开发与应用研究;酶抑制剂、激活剂的开发与应用研究;6.模拟酶、合成酶的研究;模拟酶、合成酶的研究;7.抗体酶、核酸酶的研究;抗体酶、核酸酶的研究;8.酶的定向进化技术。
酶的定向进化技术。
(一)疾病诊断
(一)疾病诊断
(二)疾病治疗
(二)疾病治疗(三)药物生产(三)药物生产(四)分析检测(四)分析检测四、酶在医药领域的应用四、酶在医药领域的应用1.通过通过酶活力变化酶活力变化进行疾病诊断进行疾病诊断酶酶疾病与酶活力变化疾病与酶活力变化淀粉酶淀粉酶胰脏疾病,肾脏疾病时升高;肝病时下降胰脏疾病,肾脏疾病时升高;肝病时下降胆碱酯酶胆碱酯酶肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等,活力下降肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等,活力下降酸性磷酸酶酸性磷酸酶前列腺癌、肝炎、红血球病变时,活力升高前列腺癌、肝炎、红血球病变时,活力升高碱性磷酸酶碱性磷酸酶佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时,活力佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时,活力升高;软骨发育不全等,活力下降升高;软骨发育不全等,活力下降谷丙转氨酶谷丙转氨酶/谷谷草转氨酶草转氨酶肝病、心肌梗塞等,活力升高肝病、心肌梗塞等,活力升高-谷氨酰转肽酶谷氨酰转肽酶(-GT)原发性和继发性肝癌,活力增高至原发性和继发性肝癌,活力增高至200单位以上,阻塞性单位以上,阻塞性黄疸、肝硬化、胆道癌等,血清中酶活力升高黄疸、肝硬化、胆道癌等,血清中酶活力升高胃蛋白酶胃蛋白酶胃癌,活力升高;十二指肠溃疡,活力下降胃癌,活力升高;十二指肠溃疡,活力下降磷酸葡糖变位酶磷酸葡糖变位酶肝炎、癌症,活力升高肝炎、癌症,活力升高端粒酶端粒酶癌细胞中含有端粒酶,正常体细胞内没有端粒酶活性癌细胞中含有端粒酶,正常体细胞内没有端粒酶活性肌酸磷酸激酶肌酸磷酸激酶(CK)心肌梗塞,活力显著升高;肌炎、肌肉创伤,活力升高心肌梗塞,活力显著升高;肌炎、肌肉创伤,活力升高2.用酶测定用酶测定物质的量的变化物质的量的变化进行疾病诊断进行疾病诊断酶酶测定的物质测定的物质用途用途葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖葡萄糖测定血糖、尿糖,诊断糖尿病测定血糖、尿糖,诊断糖尿病尿素酶尿素酶尿素尿素测定血液、尿液中尿素的量,测定血液、尿液中尿素的量,诊断肝脏、肾脏病变诊断肝脏、肾脏病变谷氨酰胺酶谷氨酰胺酶谷氨酰胺谷氨酰胺测定脑脊液中谷氨酰胺的量,测定脑脊液中谷氨酰胺的量,诊断肝昏迷、肝硬化诊断肝昏迷、肝硬化胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶胆固醇胆固醇测定胆固醇含量,诊断高血脂测定胆固醇含量,诊断高血脂等等DNA聚合酶聚合酶基因基因通过基因扩增,基因测序,诊通过基因扩增,基因测序,诊断基因变异、检测癌基因断基因变异、检测癌基因3.酶在酶在疾病治疗疾病治疗方面的应用方面的应用酶酶来来源源用用途途淀粉酶淀粉酶胰脏、麦芽、微生物胰脏、麦芽、微生物治疗消化不良,食欲不振治疗消化不良,食欲不振溶菌酶溶菌酶蛋清、细菌蛋清、细菌治疗各种细菌性和病毒性疾病治疗各种细菌性和病毒性疾病尿激酶尿激酶人尿人尿治疗心肌梗塞治疗心肌梗塞链激酶链激酶链球菌链球菌治疗血栓性静脉炎,咳痰,血肿,治疗血栓性静脉炎,咳痰,血肿,下出血,骨折下出血,骨折青霉素酶青霉素酶蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌治疗青霉素引起的变态反应治疗青霉素引起的变态反应L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶大肠杆菌大肠杆菌治疗白血病治疗白血病超氧化物歧化超氧化物歧化酶酶微生物,植物,动物微生物,植物,动物预防辐射损伤,治疗红斑狼疮,皮预防辐射损伤,治疗红斑狼疮,皮肌炎,结肠炎肌炎,结肠炎胶原酶胶原酶细菌细菌分解胶原,消炎,化脓,脱痂,治分解胶原,消炎,化脓,脱痂,治疗溃疡疗溃疡溶纤酶溶纤酶蚯蚓蚯蚓溶血栓溶血栓核糖核酸酶核糖核酸酶胰脏胰脏抗感染,祛痰,治肝癌抗感染,祛痰,治肝癌4.酶在酶在药物制造药物制造方面的应用方面的应用酶酶来源来源用途用途青霉素酰化酶青霉素酰化酶微生物微生物制造半合成青霉素和头孢制造半合成青霉素和头孢菌素菌素11-羟化酶羟化酶霉菌霉菌制造氢化可的松制造氢化可的松L-酪氨酸转氨酶酪氨酸转氨酶细菌细菌制造多巴(制造多巴(L-二羟苯丙氨酸)二羟苯丙氨酸)-甘露糖苷酶甘露糖苷酶链霉菌链霉菌制造高效链霉素制造高效链霉素酰基氨基酸水解酶酰基氨基酸水解酶微生物微生物生产生产L-氨基酸氨基酸5-磷酸二酯酶磷酸二酯酶桔青霉等微生物桔青霉等微生物生产各种核苷酸生产各种核苷酸多核苷酸磷酸化酶多核苷酸磷酸化酶微生物微生物生产聚肌胞,聚肌苷酸生产聚肌胞,聚肌苷酸无色杆菌蛋白酶无色杆菌蛋白酶细菌细菌由猪胰岛素(由猪胰岛素(Ala-30)转变)转变为人胰岛素(为人胰岛素(Thr-30)核糖核酸酶核糖核酸酶微生物微生物生产核苷酸生产核苷酸蛋白酶蛋白酶动物、植物、微生物动物、植物、微生物生产生产L-氨基酸氨基酸-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶黑曲霉等微生物黑曲霉等微生物生产人参皂甙生产人参皂甙-Rh25.酶在酶在分析检测分析检测方面的应用方面的应用
(1)酶试剂盒酶试剂盒过氧化氢酶检测试剂盒过氧化氢酶检测试剂盒(CatalaseAssayKit)通过显色反应来检测细胞、组织或其它样品通过显色反应来检测细胞、组织或其它样品中过氧化氢酶活性中过氧化氢酶活性
(2)酶联免疫酶联免疫(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)免疫检测:
让免疫检测:
让抗体抗体与与酶复合物酶复合物结合,然后通结合,然后通过过显色显色来检测。
来检测。
间接法间接法ELISA检测检测夹心法夹心法ELISA检测检测竞争法竞争法ELISA检测检测5.酶在酶在分析检测分析检测方面的应用方面的应用(3)酶标基因探针酶标基因探针将酶与将酶与DNA直接进行交联直接进行交联,杂交后只要与酶杂交后只要与酶的底物显色便能观察结果。
的底物显色便能观察结果。
检测乙肝病人血清中的检测乙肝病人血清中的HBVDNA检测转基因材料及其后代检测转基因材料及其后代5.酶在酶在分析检测分析检测方面的应用方面的应用(4)酶传感器酶传感器5.酶在酶在分析检测分析检测方面的应用方面的应用第二节第二节酶工程技术酶工程技术1.液体酶制剂:
液体酶制剂:
稀酶液稀酶液/浓缩酶液,纺织工业浓缩酶液,纺织工业2.固体粗酶制剂:
固体粗酶制剂:
粗酶液处理获得,皮革处理粗酶液处理获得,皮革处理/纤维素水解等纤维素水解等3.纯酶制剂纯酶制剂:
结晶、分离纯化后获得,分析试剂结晶、分离纯化后获得,分析试剂/药用酶药用酶酶制剂的类型酶制剂的类型学生授课学生授课结合课本和酶工程所学内容,请各位同学按结合课本和酶工程所学内容,请各位同学按照以下分组情况准备照以下分组情况准备20min左右的授课内容左右的授课内容及及ppt(下周一每组选(下周一每组选1位同学在课堂上进行位同学在课堂上进行讲授),计入平时成绩。
讲授),计入平时成绩。
酶制剂的来源及制备(酶制剂的来源及制备(1-10号)号)酶的分离纯化(酶的分离纯化(11-20号)号)酶与细胞的固定化(酶与细胞的固定化(21-30号)号)酶反应器(酶反应器(31-41号)号)第三第三节节酶工程研究酶工程研究新技术新技术本节内容本节内容核酶核酶/脱氧核酶脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相的酶反应有机相的酶反应酶分子的定点改造酶分子的定点改造酶分子的定向进化酶分子的定向进化酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰一、核酶(一、核酶(ribozyme)(一一)核酶的发现核酶的发现(一一)核酶的发现核酶的发现上世纪上世纪80年代初期,美国科罗拉多大学博尔年代初期,美国科罗拉多大学博尔德分校的德分校的ThomasCech和美国耶鲁大学的和美国耶鲁大学的SidneryAltan各自独立地发现各自独立地发现RNA具有生物具有生物催化功能催化功能,从而改变了生物催比剂的传统概,从而改变了生物催比剂的传统概念。
念。
T.Cech和和S.Altman共同获得了共同获得了1989年度年度诺贝诺贝尔化学奖尔化学奖。
T.Cech的研究工作的研究工作S.Altman的研究工作的研究工作启示:
启示:
T.Cech为什么能发现为什么能发现RNA的催化作用并获的催化作用并获得诺贝尔奖?
得诺贝尔奖?
如果你是一个如果你是一个不为常识所束缚不为常识所束缚的人,那么,的人,那么,你有可能获诺贝尔奖你有可能获诺贝尔奖S.Altman为什么能发现为什么能发现RNA的催化作用并的催化作用并获得诺贝尔奖?
获得诺贝尔奖?
如果你能如果你能根据别人刚刚发表的成果马上修正根据别人刚刚发表的成果马上修正自己的研究工作自己的研究工作,那么,你有可能获诺贝尔,那么,你有可能获诺贝尔奖。
奖。
认真做实验认真做实验认真看文献认真看文献1.核酶:
核酶:
具有生物催化功能的具有生物催化功能的RNA。
生物催化剂生物催化剂(Biocatalyst)蛋白质类:
天然酶蛋白质类:
天然酶enzyme极端酶极端酶extremozyme抗体酶抗体酶abzyme生物工程酶生物工程酶其它:
其它:
模拟酶模拟酶modelenzyme核酸类核酸类:
核酶核酶ribozyme脱氧核酶脱氧核酶deoxyribozyme
(二)核酶的概念和分类
(二)核酶的概念和分类核酶与蛋白质酶的比较核酶与蛋白质酶的比较蛋白质酶的蛋白质酶的一级结构一级结构比核酶复杂比核酶复杂蛋白质酶具有一定蛋白质酶具有一定空间构象空间构象,酶的活性中心,酶的活性中心具有刚性,核酶不具备具有刚性,核酶不具备蛋白质酶的蛋白质酶的活性中心活性中心由氨基酸组成,核酶的由氨基酸组成,核酶的活性中心是金属离子活性中心是金属离子核酶可以既是催化剂又是核酶可以既是催化剂又是底物底物,蛋白酶只是,蛋白酶只是催化剂;催化剂;核酶可以核酶可以传递遗传信息传递遗传信息,蛋白酶不可以,蛋白酶不可以I型内含子型内含子剪接型核酶剪接型核酶mRNA前体自我拼接前体自我拼接II型内含子型内含子内切核酸酶内切核酸酶+连接酶连接酶锤头核酶锤头核酶剪切型核酶剪切型核酶发夹核酶发夹核酶丁型肝炎病毒(丁型肝炎病毒(HDV)核酶核酶RNA切割切割蛋白质蛋白质-RNA复合酶复合酶2.核酶的分类核酶的分类(三)核酶在医药领域的应用(三)核酶在医药领域的应用核酶治疗疾病的原理核酶治疗疾病的原理核酶的给药途径核酶的给药途径外源性给药外源性给药:
直接将抗核酸酶降解的核酸注:
直接将抗核酸酶降解的核酸注射到组织或细胞内。
射到组织或细胞内。
内源性给药内源性给药:
利用基因疗法,借助逆转录病:
利用基因疗法,借助逆转录病毒载体和腺伴随病毒运送核酶毒载体和腺伴随病毒运送核酶核酶的给药途径核酶的给药途径核酶在医学上的应用核酶在医学上的应用展望展望二、脱氧核酶(deoxyribozyme)利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的的单链单链DNA片段片段,具有高效的催化活性和结构识,具有高效的催化活性和结构识别能力别能力对于脱氧核酶的研究有望成为基因功能研究、核对于脱氧核酶的研究有望成为基因功能研究、核酸突变分析、治疗肿瘤、对抗病毒及肿瘤等疾病酸突变分析、治疗肿瘤、对抗病毒及肿瘤等疾病的新型基因治疗药物的新型核酸工具酶。
的新型基因治疗药物的新型核酸工具酶。
核酶核酶/脱氧核酶面临的问题脱氧核酶面临的问题三、抗体酶(三、抗体酶(abzyme)
(一)抗体酶的概念与特点
(一)抗体酶的概念与特点1.抗体酶抗体酶/催化抗体(催化抗体(catalyticantibody)u利用酶反应中利用酶反应中底物过渡态类似物底物过渡态类似物作为半抗原作为半抗原刺激免疫系统所产生的一类能够专一识别和刺激免疫系统所产生的一类能够专一识别和催化酶反应中的催化酶反应中的底物反应过渡态底物反应过渡态的一类的一类单克单克隆抗体隆抗体,本质上是一类,本质上是一类具有催化活性的免疫具有催化活性的免疫球蛋白球蛋白。
2.抗体酶的特点抗体酶的特点u相同点:
都是相同点:
都是蛋白质蛋白质,都有,都有特异性特异性。
u不同点:
不同点:
1)抗体无)抗体无催化活力催化活力,酶有催化活力。
,酶有催化活力。
2)酶是能与反应)酶是能与反应过渡态过渡态选择结合的催化物质,选择结合的催化物质,抗体是和抗体是和基态基态紧密结合的物质。
紧密结合的物质。
3)酶的活性和合成受到)酶的活性和合成受到代谢调节代谢调节,抗体只有在,抗体只有在抗原存在时才产生。
抗原存在时才产生。
抗体与酶的异同:
抗体与酶的异同:
u酶的催化在于能结合底物产生过渡态,酶的催化在于能结合底物产生过渡态,降低能障(反应的活化能)。
降低能障(反应的活化能)。
u以以过渡态类似物过渡态类似物作为半抗原,诱导与其作为半抗原,诱导与其互补构象的抗体,使其具有催化活性,可观互补构象的抗体,使其具有催化活性,可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。
察到抗体催化相应底物发生化学反应。
u直接免疫动物直接免疫动物/杂交瘤技术杂交瘤技术/基因工程技术基因工程技术3.抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法
(1)诱导法诱导法动物免疫技术动物免疫技术+杂交瘤技术杂交瘤技术利用利用底物过渡态类似物底物过渡态类似物制备抗体酶示意图制备抗体酶示意图u原理:
掌握现有单克隆抗体的原理:
掌握现有单克隆抗体的抗体结合抗体结合部位的氨基酸顺序部位的氨基酸顺序的基础上,对编码抗体的基础上,对编码抗体酶结合部位的酶结合部位的基因碱基序列基因碱基序列进行进行定点突变定点突变,在结合部位换上有在结合部位换上有催化作用催化作用的氨基酸残基,的氨基酸残基,进而改变抗体酶的催化效率。
进而改变抗体酶的催化效率。
u噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术/噬菌体展示技术噬菌体展示技术
(2)基因工程法基因工程法
(1)前药的设计和活化前药的设计和活化n抗肿瘤药物:
喜树碱、阿霉素、依托泊苷抗肿瘤药物:
喜树碱、阿霉素、依托泊苷4.抗体酶的应用抗体酶的应用
(2)疾病治疗疾病治疗n治疗可卡因上瘾治疗可卡因上瘾n有机磷中毒有机磷中毒n甲状腺疾病甲状腺疾病肿瘤治疗肿瘤治疗抗体介导前药治疗抗体介导前药治疗(ADEPT):
向体内注射能够与肿瘤组织特异性结合的抗向体内注射能够与肿瘤组织特异性结合的抗体酶,当其结合到靶部位后,再注入前药,体酶,当其结合到靶部位后,再注入前药,当药物扩散至肿瘤细胞表面或附近时,抗体当药物扩散至肿瘤细胞表面或附近时,抗体酶可快速将其水解并释放出抗肿瘤药物,从酶可快速将其水解并释放出抗肿瘤药物,从而提高局部药物浓度,实现靶向治疗。
而提高局部药物浓度,实现靶向治疗。
催化抗体催化抗体38C2戒毒戒毒阻断可卡因、鸦片和受体的结合阻断可卡因、鸦片和受体的结合可卡因水解的过渡态类似物可卡因水解的过渡态类似物磷酸单酯磷酸单酯单克隆抗体酶单克隆抗体酶15A10:
在可卡因到达作用位:
在可卡因到达作用位点前将其降解,从而降低其毒性点前将其降解,从而降低其毒性
(1)应用应用u有机合成中的应用有机合成中的应用u基础理论研究基础理论研究u在医疗上的应用在医疗上的应用5.抗体酶的发展前景抗体酶的发展前景
(2)待解决问题待解决问题u催化效率催化效率u抗体酶筛选抗体酶筛选u抗体酶专一性抗体酶专一性u底物抑制底物抑制u催化基团的最适装配催化基团的最适装配四、有机相的酶反应四、有机相的酶反应
(一)有机相酶反应的特点
(一)有机相酶反应的特点q有利于疏水性底物的反应有利于疏水性底物的反应q可提高酶的热稳定性,提高反应温度加速反应可提高酶的热稳定性,提高反应温度加速反应q可改变反应平衡移动方向可改变反应平衡移动方向q可改变底物专一性可改变底物专一性q可防止由水引起的副反应可防止由水引起的副反应q酶易于实现固定化酶易于实现固定化q酶和产物易于回收酶和产物易于回收q可避免微生物污染可避免微生物污染
(二)有机相酶反应具备条件
(二)有机相酶反应具备条件保证必需水含量。
保证必需水含量。
选择合适的酶及酶形式。
选择合适的酶及酶形式。
选择合适的溶剂及反应体系。
选择合适的溶剂及反应体系。
选择最佳选择最佳pH值。
值。
四、有机相的酶反应四、有机相的酶反应(三)有机相酶反应的溶剂体系(三)有机相酶反应的溶剂体系单相共溶剂体系(水单相共溶剂体系(水-水溶性溶剂均相体系)水溶性溶剂均相体系)两相体系(水两相体系(水-水不溶性溶剂两相体系)水不溶性溶剂两相体系)反相胶束体系反相胶束体系低水有机溶剂体系(单相有机溶剂体系)低水有机溶剂体系(单相有机溶剂体系)四、有机相的酶反应四、有机相的酶反应(四)有机相酶工程的应用(四)有机相酶工程的应用手性药物的拆分手性药物的拆分手性高分子聚合物的制备手性高分子聚合物的制备多肽的合成多肽的合成甾体转化甾体转化五、突变酶(五、突变酶(mutationalenzyme)u在已知酶的结构与功能的基础上,有目的地改在已知酶的结构与功能的基础上,有目的地改变酶的活性位点或基团,从而产生具有新性状变酶的活性位点或基团,从而产生具有新性状的的突变酶突变酶。
u理性分子设计理性分子设计u思路:
利用思路:
利用定点突变技术定点突变技术有目的地在已知有目的地在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸序列中取代、插入或删除特定的核苷酸方法方法1.寡核苷酸介导的定点突变:
寡核苷酸介导的定点突变:
u用含有突变碱基的寡核苷酸片段做引物,在用含有突变碱基的寡核苷酸片段做引物,在体外以原基因序列为模板进行复制,诱变合体外以原基因序列为模板进行复制,诱变合成少量完整的突变基因,再体内扩增成少量完整的突变基因,再体内扩增2.盒式突变:
盒式突变:
u利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。
苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。
应用应用1.提高酶活性及稳定性提高酶活性及稳定性阐明酶分子中某一基团的功能阐明酶分子中某一基团的功能2.研究酶的功能基团研究酶的功能基团酶同源序列的比较酶同源序列的比较选择突变靶标选择突变靶标化学修饰化学修饰酶的二、三级结构酶的二、三级结构六、酶分子的定向进化六、酶分子的定向进化以已知的亲本野生酶为起点,经过随机的基以已知的亲本野生酶为起点,经过随机的基因突变或重组,构建一个包括多种突变酶基因突变或重组,构建一个包括多种突变酶基因的因的蛋白酶文库蛋白酶文库,在此基础上进一步通过定,在此基础上进一步通过定向的选择性筛选,从中获得具有某些定向功向的选择性筛选,从中获得具有某些定向功能或性状的酶分子能或性状的酶分子非理性分子设计非理性分子设计原理:
人为模拟自然进化机制,利用分子生原理:
人为模拟自然进化机制,利用分子生物学手段结合灵敏的筛选技术,获得具有某物学手段结合灵敏的筛选技术,获得具有某些预期特征的进化酶。
些预期特征的进化酶。
方法方法1.随机突变随机突变易错易错PCR:
通过改变:
通过改变PCR的反应条件使碱基的反应条件使碱基一定程度上一定程度上随机错配随机错配,导致目的基因随机突,导致目的基因随机突变,构建突变库,筛选突变体。
变,构建突变库,筛选突变体。
2.同源改组同源改组有性有性PCR:
亲本基因群中的优化突变:
亲本基因群中的优化突变3.非同源改组非同源改组渐进切割杂合酶技术:
用核酸外切酶对两个渐进切割杂合酶技术:
用核酸外切酶对两个亲本基因分别进行消化,再将两组片段化基亲本基因分别进行消化,再将两组片段化基因互相连接因互相连接方法方法4.结构域改组结构域改组利用内含子之间的重组使独立的外显子组装利用内含子之间的重组使独立的外显子组装成编码新蛋白质的基因成编码新蛋白质的基因5.其他技术其他技术酶法体外随机酶法体外随机-定位诱变技术定位诱变技术酵母细胞重组增强组合文库技术酵母细胞重组增强组合文库技术筛选策略筛选策略底物显色反应底物显色反应改变培养条件改变培养条件利用蛋白固有性质利用蛋白固有性质高通量筛选高通量筛选固相筛选固相筛选放射性染料筛选放射
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