分子病理检测及其质量控制.pptx
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分子病理检测及其质量控制.pptx
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分子病理检测及其质量控制医院病理科分子病理是精准医疗的重要部分精准医疗:
是一种新型医疗方式个体化差异基环因境、生活方式预防、诊断、治疗精准医疗计划:
精准医疗概念进入临床实践分子病理快速发展分子设备及技术快速发展驱动基因不断鉴定各种分子标志物不断发现临床需求越来越多:
“快”、“准”,“全”需要分子病理与个体化治疗共同发展肿瘤诊断模式的改变MolecualarSingle-stepdiagnosisMulti-stepdignosisMorphologicalMorphologicalIHC经验证据主观客形态分子,定性定量分子病理基础和主要应用分子遗生传物学技术诊断分型靶向治疗DNARNA异常蛋白根据疾病与基因肿异瘤常组织的关系易感性/毒遗副传作性用/外周血(有正核常细组胞织)手术标本为病理诊断、临床治疗提供更多有价值的信息!
.预后判断疗效监测耐药机制细胞学标本CTC(外周血)(ctDN)分子病理诊断已应用到常见肿瘤肺癌结直肠癌淋巴瘤乳腺癌淋巴瘤软组织肿瘤卵巢癌黑色素瘤甲状腺肿瘤脑肿瘤.分子异常形式决定技术平台染色体异常易位/倒转/缺失/插入/重复基因结构异常重排(基因内、外)/扩增/突变/MSI基因修饰异常DNA甲基化/组蛋白乙酰化mRNA根据异常形式,选择恰当的技术平台分子病理技术基因异常形式扩增FISH/SISH/CISH,基可用技术代测序.因芯片、二染色体易位/基因融合染色体分析,FISH,RT-PCR、二代测序.基因突变DNA测序,ARMS,焦磷酸测序、ddPCR、二代测序.DNA拷贝数/mRNAISH、荧光定量PCR、基因芯片、二代测序.基因重排微卫星不稳定DNA片段分析、二代测序化SP、焦磷酸测序、seqemeon、二代测序.甲多基因异常M基因芯片、nanostring、seqemeon、二代测序.8分子病理流程和基本技术平台组织细胞标本准备D5S346切片切片选择、病理质控核酸提取ISH/FISH/SISHPCRbased检测主要内容FISH检测及其应用PCR为基础的相关技术及其应用FISH及PCR相关检测的质量控制10主要内容FISH检测及其应用分子检测中的质量保证和质量控制11FISH检测的原理直接:
探针直接标记荧光素间接:
探针标记生物素/地高辛-间接抗XXX荧光素荧光显微FISH检测的主要应用(基因扩增HER2、MET)(、BCL1)ALKROS1EWSR1基因缺失(PTEN、1p/19q)FISH法检测Her-2基因扩增乳腺癌:
25%-30%胃癌:
10%-30%乳腺癌Her-2/neu基因状态的意义预后无论因淋子巴:
结状态如何预测因子:
内分泌治疗HER2阳性患者相对耐药C蒽M环F类方案对HE大R剂2阳量性蒽患环者类相相对对耐敏药感紫杉类药物相对敏感靶向治疗靶点:
Her-2状态指导靶向治疗2013HER2ISH判断流程及主要更新点双探针:
比值的阈值改变HER2拷贝数结合阈值和拷贝数两个参数胃癌中HER2状态及其临床价值胃食管交界处和胃进展期胃癌曲妥珠单抗治疗显著延长生存期靶向治疗患者筛选、疗效预测依据胃癌HER2检测指南(2011版)阳性阴性IHC不确定胃癌的HER2检测流程3+报告为HER2阳性适合治疗0/1+报告为HER2阴性不适合治疗2+ISHFISH/(D)SISH/CISH胃癌中HER2阳性特点与组织学类型相关:
肠型、混合型、弥漫型与肿瘤部位相关:
胃食管交界处、胃IHCISH30%2IHC中+的病例比例可能高与标本类型有关:
手术标本活检IHC和FISH不一致更多见,IHC阴性:
报道7.5%ISH阳性FISH检测的重要环节方法选择:
单探针/双探针?
探针性能蜡块选择:
活检/手术?
冰冻/石蜡?
原发/转移?
检测过程:
切片-脱(蜡手-水工化、-全消自化动-杂)交-洗涤-封片结果判读:
质量、区域、计数、结果报告及其解释计数细胞核选择大小一致;胞核边界完整;DAPI染色均一;细胞核无重叠;CEPl7绿色信号清晰;20个癌细胞核中的双色信号至少融合或簇状信号数估计阴倍性体,多ImagesfromFUSCC阴性阳性性FISH在检测染色体易位中的应用基础:
非随机性染色体异常,与类型有关肿瘤:
淋巴瘤、软组织肿瘤、肺癌、甲状腺肿瘤应用:
诊断、分型、靶向治疗易位的模式图9号染色体22号染色体检测易位的探针类型融合探针分离探针淋巴瘤中的频发特异染色体异常淋巴瘤类型非随机染色体异常涉及基因CLL/SLLDel13q14unknownTrisomy12unknownDel11q22-23ATMDLPt(9:
14)(p13;q32)PAX-5/IGHMALT-MZL1;18)(q1;q1)CIAP2MLTt(1;14)(p22;q32)BCL10/IGHt(14;18)(q32;q21)IGH/MALT1FLt(14;18)(q32;q31)BCL-2/IGHMCL)(q13;q32)41;11cyclinD1/IGHt(3q27)BCL6DLBCLBL14;18)(q32;q1)BCL-2/IGHt(8;14)(q24;q32)myc/IGH28)(p11;q24)IGLK/myct(8;22)(q24;q11)myc/IGLLALCL套细胞淋巴瘤的诊断特征性t(11;14)(BCL1-IGH)95%,少数:
IGK,IGLt(11;14)+t(11;14)-61M,(十二指肠球部、升结肠、横结肠)活检组织小而破碎IGH/CCND1DualColor,DualFusionTranslocationProbe侵袭性B细胞淋巴瘤的鉴别诊断BCL6分离探针MYC分离探针BCL2-IgH融合探针舌根部肿块,54F:
DLBCL?
Burkitt?
DH-BL?
治疗和预后不同MYC基因易位+BCL6基因易位+BCL2基因易位-最后诊断:
Double-Hit淋巴瘤肿瘤类型Synovialsarcoma染色体易位融合基因t(X;18)(p11.2;q11.2)SYT-SSX1(66%)SYT-SSX2(33%)SYT-SSX4(1%)Ewinnegursoescatrocdoemram/altumorPrimitiveClear-cellsarcomat(11;22)(q24;q12)EWSFLI1(85%)t(21;22)(q22;q12)EWSERG(1015%)t(7;22)(p22;q12)EWSETV1(1%)t(17;22)(q12;q12)EWSE1AF(90%)t(12;22)(q13;q12)EWSDDIT3(rare)Dermatofibrosarcomaprotuberanst(2;13)(q35;q14)PAX3FKHR(55%)t(1;13)(q36;q14)PAX7FKHR(22%)Congenitalfibrosarcomat(17;22)(q22;q13)COL1A1PFGFB(74%)Alveolarsoftpartsarcomat(12;15)(p13;q25)ETV6NTRK3Inflammatorymyofibroblastictumort(X;17)(p21;q25)ASPLTFE3Low-gradefibromyxoidsarcomat(2;5)(p23;q35)TPM3,4ALK(38%)t(2;17)(p23;q23)CLTCALK(25%)t(7;16)(q33;p11)FUSCREB3L2软组织肿瘤中的频发特异染色体异常23岁,男,右腋窝肿块,形态多样内对照SYT-SSX2SYT-SSX1SYT-SSX软组织肿瘤诊断与鉴别诊断SYT-FISH+最后诊断:
滑膜肉瘤(synovialsarcoma)主要内容FISH检测及其应用分子检测中的质量保证和质量控制34PCR及分析技术PCR-凝胶电泳:
特异性片段、片段大小PCR-毛细管电泳:
序列分析、片段长度分析NGS:
多基因突变、易位、表达等PCRmRNA其他相关技术:
DHPLC,PCR-SSCP。
琼脂糖凝胶电泳PCR-凝胶电泳聚电丙泳烯凝胶PCR法检测淋巴瘤中克隆性重排不同的淋巴细胞,相同的重排形式,淋巴细胞单克隆性增生确定恶性克隆的存在,是淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标应用:
诊断与鉴别诊断;谱系确定;分期,外周血、骨髓累及克隆相关性判断PCR法-最常用的克隆性重排检测方法1.聚丙烯凝胶电泳法分析2.基因扫描分析66M,胃黏膜活检43F,左腮腺肿块基因重排的应用明显的浆样分化细胞基因重排的应用诊断:
胃黏膜(胃)小活检标本:
FR1(+),FR2(+),FR3(+)左腮腺肿块:
B细胞淋巴瘤,倾向MALT边缘区B细胞淋巴瘤MALT边缘区B细胞淋巴瘤毛细管电泳基因扫描(genescanning)敏感快速分辨率高可获得更多信息具有优势P片C段R分-析毛(细基因管扫电描)泳、突的变应分析用测序分析图谱DNA抽提基因扫描图手活检标本胸水等细胞PCR扩增PCR产物电泳PCR产物纯化遗传分析仪R*PCR是关键:
-特异性-产物长度-必要时巢式-建议通用测序引物基因扫描在克隆性重排分析中的应用单克隆性细胞产生一个或两个尖的峰,多克隆为多个小峰,呈分IGH-A78F,胃窦、胃底活检组织,组织较小,CD20+、CD79+、bcl6+、+、Ki6795%等结合形态、IGH-BIGH-CIGK-AIGK-B阴性对照微卫星不稳定(MSI)检测的临床价值45遗有传结性直非肠息癌肉家性族结史直的肠患癌者(应HN做PCMCM)R筛或选MS:
I检测。
若IHC-MLH1蛋白缺失,还需检测BRAF突变分II化期差病的人病伴理有M类SI型-H如时果预伴后有好MSI-H则不认为是高危因素不会从5-FU辅助治疗中获益。
PD-1抑制剂是否获益的指标MSI分析检测方法NCI:
Bethesdaconsensuspanel:
2个单、3个双;Promega:
单核苷酸重复panel:
5个单;或更多分别对同一病例的正常和肿瘤组织进行显微切割、核酸提判断方法:
2个及以上不稳定MSI-H1个不稳定MS-I,L或不确定没有不稳定MSSMSI分析方法PCR-毛细管电泳提正常和肿瘤组织DNA提取PCR扩增PCR反应毛细管电泳结果分析遗传分析仪68F直肠腺癌,T4N0M0MSSD5S346Bat26Bat25D17S250D2S12373M,左半结肠腺癌,T3N0M0,MSI-HD5S346Bat26Bat25D17S250D2S123Sanger测序的检测内容和应用检测内容:
点突变、小片段缺失、插入临床应用:
结直肠癌中KRAS、NRS和BRAF基因状态突变肺癌中EGFR、KRAS、ALK基因异常。
胃肠道间质肿瘤(GIST)分子分型(散极少发见,家族K突I变T/型PDGFRAPKDIGTFRA58-100%SDH缺陷型SSDDHHAB/BI/HCC/D缺突失变散发性)传,少数、Ca遗rney-51K野I生T/PDGFRA型SDH非缺陷型NF1(甲基少化1)triad上述均阴性BRA其F(他少基因1:
)PIK3CA胃肠道间质瘤中KIT和PDGFRA突变功能获得性KIT突变:
大多数-CD117阳性PDGFR突变:
少部分细胞表面酪氨酸激酶持续性活化,细胞增殖失控GIST中KIT和PDGFRA突变KITPDGFRA总突变率:
87.4%细胞膜细胞质外显子9(1%)外显子1(67.5%)外显子13(0.9%)外显子17(0.5%)外显子12(0.9%)外显子18(6.3%)外显子14(0.3%)GIST中分子病理应用协助诊断疑难GIST:
c-kit或PDGFRA突变分析协助诊断族性特殊类型GIST:
NF1型、完全或不完全Carneys三联症、家GIST以及儿童GIST术前拟用分子靶向治疗所有初次诊断的复发和转移性GIST,拟用分子靶向治疗原疗发可切除GIST手术后,中-高度复发风险,拟用伊马替尼辅助治二次突变检测继发性耐药需要重新检测KIT和PDGFRA突变检测范围原发性:
KIT:
Exon9,11,13,14,17,18PDGFRA:
Exon12,14,18PDGFRA:
Exon14,KIT:
Exon13,14,17,1818突变类型与突变类型与发生部位有一定关系imatinib的敏感性有一定关系突变位点对Imatinib的反应KIT突变Exon11反应最好Exon9反应中等Exon13反应差突变类型与靶向治疗敏感性的关系反应差D842V反应差,其余敏感PDGFRA无突变反应差Exon17Exon18继发型突变对靶向治疗抵抗220230240250260270280290300310AGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC-AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAAAGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC-AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAAAGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTACAG-GTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAAAGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTACAGTGGAAGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAACGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC-AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAACGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC-AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAA320330340350360370380390400410420CAACTTCCTTATGATCACAAATGGGAGTTtCCCAGAAACAGGCTGAGTTTTGGTCAGTATGAAACAGGGGCTTTCCATGTCAATGTCAATATGTTGGCTTTCGGCAACTTCCTTATGATCACAAATGGGAGTT-CCCAGAAACAGGCGAAGGC胃间质瘤:
第十一外显子检出6个碱基纯合性缺失:
c1669-1674delTGGAAG。
该缺失可造成第557位密码子色氨酸(Trp,W)和558位密码子赖氨酸(合一性例)小,肠导G致IST中KIT第9外显子突变:
可见c.1504-1509dupGCCTAT(杂图为该病例正向p.5测02序-5结03果d)upAY。
(上图为KIT基因第9外显子野生型序列,下结直肠癌是一组异质性肿瘤散发性遗传性-HNPCC、FAP等家族相关性SporadicFamilial分子机制染色体不稳定性(CIN):
散发、遗传微卫星不稳定性(MSI):
散发、遗传基因组不稳定性(genomicinstability)表观遗传不稳定性(epigeneticinstability)分子C分pG型岛的甲基子表型(CIMP):
散发各种组合方式:
5组、4组、7组等KRAS、NRAS、BRAF、MSI和CIMP状态主要涉及:
尚无国际通用的标准的分子分型RAS突变靶向治疗获益人群的筛选BRAF突变预后价值尚不肯定并不从5-FU单药辅助治疗中获益PD-1抑制剂是否获益的指标遗传性结直肠癌筛选SNP、分子分型.结直肠癌中分子病理应用60结直肠肿瘤生成中RAS的作用EGFR(HER1)EGFTGF-HB-EGFEpiregulinRASRAFMEKERK1.DeRoock,etal.LancetOncol20102.3.Fernndez-Medarde,Santos.GenesCancer2011;4.DeRoock,etal.LancetOncol2011RAS基因家族K-RAS:
E2,3,4N-RAS:
E2,3,4H-RAS:
RAS突变导致持续信号激活,与是否EGFR抑制无关PRIME研究中RAS/RAF分析常见的KRAS外显子2基因突变以外,其他RAS基因突变(KRAS外显子3和4,NRAS外显子2、3和4)约占总肠癌人群的10%RAS野生型患者相比于KRAS外显子2野生型患者,帕妥木单抗联合FOLF有O显X著的中位P)异差F,S从而化9.6月提没高有到改10变.1。
月,中位OS从23.9月提高到26月(疗组DouillardJYetal.NEnglJMed2013;369:
1023-103463所有转移性CRC都应该做肿瘤组织RAS和BRAF突变检测(KRAS+NRAS+BRAF),KRAS/NRAS:
(E2+E3+E4)与panitumubcetuxmab敏感性有关原发灶、继发灶均可RAS(KRAS+NRAS)野Th型预后更好KRASorNRASRAS突变是否是其他EGFR抗体预测指标尚待进一步研究DouillardJYetal.NEnglJMed2013;369:
1023-1034BRAF基因7q34,18个外显子组成,783个氨基酸由三个保守区组成CR1、CR2、CR3(激酶区)编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是RAS-RAF-MEK-ERK上游调节因子BRAF基因突变位点80%:
激酶功能域V600EBollagG.NatRevCancer2007Apr;7(4):
295BRAF突变与结直肠癌的关系5%-9%与临床病理高危因素相关:
近端、T4、低分化目前尚无证据证明其对靶向治疗的指导作用突体变细提胞示:
MLH1甲基化,而非胚系基因突变结肠腺癌中KRAS基因突变:
KRAS12codonGGTGAT,p.G12DReal-timePCR技术在PCR反应体系中加入荧光探针;实时监测整个PCR进程;定量和定性分析荧光探针非特异性荧光标记:
1、SYBRGreen特异性荧光标记:
1、TaqMan2、蝎形探针3.环形探针TaqMan-水解型杂交探针与目标序列互补5端标记有报告基团(Reporter,R),如FAM、VIC等3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整,R所发射的荧光能量被Q基团吸收,无荧光,R与Q分开,发荧光Taq酶有53外切核酸酶活性,可水解探针TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子,释放一个荧光信号,可以在循环过程中任一点检测荧光ARMS法检测突变A等R位M基因特异性S:
amplificationrefractorymutationsystemPCR+荧光探针=ARMS方法A突变正向引物延伸产生荧光信号DNA反向引物G野生DNA模板突变正向引物无延伸反向引物Real-timePCR技术的应用突变/SNP分析:
ARMS、HRM等RNA:
判读依据:
ARMS结果判读阳性对照;内对照;曲线形态;G719XS768I外控CT计算不同试剂盒有不同标准或可自动输出NSCLC中驱动基因异常NSCLC:
肿瘤驱动基因及相应靶向药物驱动基因检测:
靶向药物选择和临床试验规范分子检测:
是规范治疗的前提和保证EGFRKRASALKfusions3-7%HER2BRAFPIK3CAAKT1MAP2K1NRASROS1fusionsKIF5B-RET上海肿瘤医院胸外科-非吸烟腺癌广州省人民医院EGFR和ALK检测主要共识EGFR&ALK是NSCLC已知的“高频”驱动基因EGFR、ALK异常患者接受相应靶向治疗,有效提高生存率“先检测,后治疗”的NSCLC靶向个体化治疗模式已成为临床的诊疗所有含腺癌成分的NSCLC需常规检测EGFR&ALK对于小活检标本或者不吸烟的鳞癌患者也建议进行。
KrisMG,etal.JAMA2014;311:
1998-2006EGFR突变与临床、病理78NSCLC主要发生于腺癌和腺鳞癌:
不吸烟、亚洲、女性常见鳞癌、神经内分泌癌、粘液性癌:
少见SCCEGFR基因TK区突变79三类突变形式:
框架内缺失:
Exon19del插入突变:
Exon20错义突变:
18-21Exon19、21:
最常见E一xo半n2为0:
原最发重性要耐突药变-T790M一半为获得性耐药ChengLetal.ModernPathol2012;25:
347-369EGFR基因突变检测方法任何检测DNA突变的方法PCRbased技术,具有敏感性和特异性采用IHC检测突变蛋白和FISH法检测EGFR拷贝数都不是作为TKI患者筛选的指标!
EGFR突变检测方法列E出MQN数据32中方法SangerDNAsequencingARMSHRMNextGensequeningTaqman,Cobas我国PQCC数据20%测序和其他80%ARMS测序法与ARMS法比较敏感度测序法10-30%AR1M%SFFPE标本成功率低高检测流程复杂、长简单快速数据分析要求高低突变类型已知和未知已知假阳性机会(交叉污染)多少假阴性机会多少高低商用试剂盒无有低高肺癌中多基因异常、多靶向治疗近10年来已发现肺腺癌的一系列驱动基因改变,并有相应靶向药物。
AGLFKR重突排变Crlioztoitniinbi,b,GAelfeitcitniinbi,bafatinibROS1重排CrizotinibMET扩增,exon14CrizotinibHER2突变Afatinib,Dacomitinib,CO-1686Selumetinib,TrametnibBRAF突变Dabrafenib,trametinibRET重排cabozatinib全程化分子检测需求初次治疗耐药进展(EGFR、ALK等)(T790耐药)组织、外周血外周血、组织NGS因其优势进入临床应用技术平台定量通量检测基因变异类型FISH否低扩增,融合免疫组化(Sanger)定量PCR是中热点突变,融合,高表达二代测序(NGS:
高通量、高灵敏度、节约样本、低碱基成本主要内容FISH检测及其应用分子检测中的质量保证和质量控制86质量保证和质量控制检测前检测中检测后(质Q量A保证)保有证效过合程理QC(质量控制)室间质评室内质控保准证确结可果靠重要质控点、注意事项检测方法性能参数的确立标本类型、病理质控重视组织前处理对分子检测的影响检测中的各种对照设立/判断标准、结果注释多平台建立、对照参加室间质评样本和数据管理88性能参数的验证或确认分析敏感性(analyticsensitivity)分析特异性(analyticspecificity)准确性(accurcy)precision89标本来源及形式手术标本活检标本细胞学材料石蜡切片4-5umF组F织P蜡E块细胞蜡块ctDNA/CTC是重要补充手术标本最理想;标本质量很关键;规范检测很重要!
样本类型手术切除标本首选、最可靠活检小标本:
细胞学标本:
重要来源穿刺细胞,脱落细胞(胸水、支气管刷取物、痰液等)细胞蜡块:
可提高阳性率病理质控基于组织的分子诊断,病理评估不可缺少;标本来源、标本类型细(胞必百要分时比进、行或细细胞胞富量集)与结果密切有关92病理质控流程组织标本接收组织处理、蜡块和H&E染色切片制作H&E染色切片病理质量控制和显微切割质量达标基因突变检测质量不达标不能进行基因突变检测蜡块未染色切片去除标记以外的区域确定标本类型、肿瘤特征分布乳腺癌胃癌HER2FISH计数区域选择胃癌的两个区域检测前处理中主要环节组织消化固定、切片ISHPCR提取DNA/RNA固定目的离体后组织改
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- 关 键 词:
- 分子 病理 检测 及其 质量 控制